融合后细胞不长或融合后克隆很少怎么办！-编程实验室

新买的SP20，融合不成功

杂交瘤虽然能长出来，但融合率不高

后面又死了好多

救救孩子吧 😭

01免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。

免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用 Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。

02SP2/0状态很重要！！！

新收到的SP2/0，由于运输和培养环境的改变，状态尚未恢复，需要先驯化适应。
刚复苏的sp2/0建议传代1~2次后，在细胞状态良好的状态下进行融合，同时可冻存状态良好的SP2/0细胞不断保种，用于后续其他融合实验。

03脾细胞状态也很重要

脾细胞在融合前的存活能力较差。这个问题可能由多种原因造成，包括免疫接种小鼠的年龄和健康状态，以及脾脏采集和融合之间的时间间隔等。建议尽快操作，在分离出脾细胞后尽快进行融合(最好在1小时内)。有些客户可能使用冻存的脾脏（细胞）成功融合过，但冻存会影响细胞活性和存活率，目前我们在这块操作上不是很建议，也没有很多经验，如果有成功的经验欢迎大家留言共享。

04HAT选择性培养基浓度不对

有些实验室可能选择自行配置，但是HAT未能很好溶解，或使用中加入了过高浓度的 HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低。建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作 HAT 浓度筛选，或者直接使用博奥龙商品化的HAT培养基添加剂。此外，注意换液去除HAT时，继续添加HT培养基添加剂，作为DNA补救合成途径的补充剂，用于杂交瘤筛选培养基的添加剂和营养添加剂，以克服细胞内残留氨基喋呤（Aminopterin）对DNA经典合成途径的抑制作用。

05未能正确制备饲养层细胞

关于操作步骤，可搜索我们前面“融合用饲养层细胞制备”的内容介绍，或选择博奥龙的Hybridoma Feeder添加因子，免去这一步骤的麻烦和污染风险

06接种杂交瘤细胞的培养板过多

一般的细胞融合中，目的融合子是 AB 型的，但是通常会得到大量的 AA，BB 这样的融合子，而且融合时 AA 和 BB 细胞自身靠得更近，所以真正能形成 AB 融合子的细胞是非常少的。

根据我们的经验：一般一个融合能获得500-1000个AB 型，如果铺板5-10板，一个板子50-200个克隆，也就是96孔板中，每个孔能大概1个融合细胞。

07融合后未及时转移或稀释细胞

有些实验室习惯在做融合后，把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到 96 孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆少的情况。

08细胞污染

在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。这一步也可在融合之前通过观察sp20的细胞状态进行确认。

此外，有些科研人员认为做完脾细胞与sp2/0细胞的融合后的细胞脆弱，完全培养基（HAT+细胞因子+双抗+164010%FBS）中的双抗会影响细胞状态，去除了双抗，但双抗抑制的是细菌的细胞壁合成和蛋白合成，对真核细胞（如杂交瘤）理论上是无毒性的。双抗是我们目前SOP要求添加的固定组分。融合过程涉及脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞获取，操作过程极易引入细菌，忽略抗生素可能导致污染，造成更大损失。脆弱细胞更需保证无污染环境。如果仍然有担心可以设置个实验对照组观察下。

09培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清

我们目前遇到最多的是客户使用的血清太差，导致细胞生长速度慢、甚至死亡的情况，这点可以考虑下博奥龙专门筛选过的杂交瘤细胞专用胎牛血清，货号也给大家放这里BF08005。

此外，可以注意下购买的SP20是RPMI1640培养基，还是DMEM或其他培养基，有些实验室需要使用无血清培养基避免血清成分对后续的感染，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出稳定后再把培养基更换为无血清培养基。

10细胞培养条件不正确

确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证 CO2 浓度在 4-5% 左右

11其它与融合条件相关的不恰当的因素

PEG融合操作属于关键步骤

01新鲜融合的细胞较为脆弱，在融合和贴壁处理前应轻柔对待。避免温度的快速变化和剧烈的移液操作，否则可能会导致细胞质膜破裂和细胞死亡。

02在融合前，血清未被有效去除。当添加PEG时，任何仍存在的蛋白质都会显著降低融合效率。

03在添加PEG之前，离心脾细胞/骨髓瘤细胞混合物后未完全去除上清液，导致PEG浓度过低。

04在添加PEG之前，细胞沉淀未充分打散。

05细胞暴露于PEG的时间过长，导致细胞死亡。