Bulk+ATAC+scRNA+TCR-seq+CUTTag+代谢+空间转录组：拆解Cell力作，掌握多组学联合分析（附代码）-编程实验室

作为人体内数量最多且反应迅速的防御细胞，中性粒细胞在癌症中究竟是“帮凶”还是“斗士”？长期以来，由于这类细胞半衰期极短、mRNA含量低，其在肿瘤微环境中的功能状态一直是个谜。

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2024年3月14日，复旦大学附属中山医院樊嘉院士、高强教授、复旦大学生物医学研究院杨力研究员及中国科学院上海免疫与感染研究所张晓明研究员团队在Cell杂志发表研究，揭示了中性粒细胞的10种状态，并重点阐明了具有抗原呈递能力的子集在抗肿瘤免疫中的作用。今天我们就来拆解一下这篇文章：Neutrophil profiling illuminates anti-tumor antigen-presenting potency。

研究概述

该研究整合了涵盖17种癌症类型的225份样本，通过高分辨率单细胞转录组分析识别出中性粒细胞的10种状态。研究重点锁定了一群高表达MHC-II类分子的HLA-DR+中性粒细胞，该亚群与多种癌症患者的良好预后相关。机制研究表明，亮氨酸代谢能通过重塑线粒体功能及表观遗传修饰，诱导中性粒细胞向抗原提呈表型分化，进而增强T细胞对肿瘤新抗原的免疫反应。

实验设计

研究人员采集了肿瘤原发灶、转移灶、癌旁组织及血液样本，采用磁珠富集结合流式分选的两步法，以确保中性粒细胞的活性与纯度。后续实验涉及体外氨基酸筛选、13C同位素示踪、代谢组学、CUT&Tag、ATAC-seq等技术分析分子机制。在功能验证阶段，利用多种小鼠肿瘤模型（LLC, MC38, Hepa 1-6）及人源肿瘤片段（PDTF）平台，评估了亮氨酸饮食及中性粒细胞回输联合PD-1抗体的治疗潜力。

研究结果

图1：团队通过泛癌单细胞整合分析，定义了中性粒细胞的10种保守功能状态，包括炎症、趋化及抗原提呈模块。

图2：组织分布分析显示HLA-DR+子集广泛存在于各类癌症中，且其特征基因表达水平越高，患者生存期越长。

图3：轨迹推演显示HLA-DR+中性粒细胞处于分化末端，并表现出活跃的支链氨基酸代谢特征。

图4：亮氨酸进入中性粒细胞后代谢产物乙酰辅酶A增加，介导H3K27ac修饰激活了MHC-II类基因的转录。

图5：抗原提呈型中性粒细胞在空间上与T细胞聚集，并能通过摄取肿瘤新抗原诱导抗原特异性T细胞反应。

图6：在小鼠模型中，特异性敲除中性粒细胞的MHC-II类分子会导致肿瘤生长加速及浸润T细胞减少。

图7：亮氨酸强化饮食或回输诱导后的中性粒细胞，可显著提升抗PD-1免疫治疗在多种模型中的完全缓解率。

数据分析

生信分析

本研究应用了单细胞转录组（scRNA-seq）、空间转录组（Spatial Transcriptomics）、批量转录组（Bulk RNA-seq）、染色质可及性测序（ATAC-seq）、组蛋白修饰测序（CUT&Tag）、T细胞受体测序（TCR-seq）以及非靶向代谢组学。

分析流程

•转录组分析：用CellRanger V7对齐基因组并保留内含子，Seurat V4.0.4过滤低质量细胞和双细胞，harmony整合批次，聚类后根据标志物筛选中性粒细胞，SingleR验证细胞类型；批量RNA-seq用STAR对齐，htseq-count计算基因表达量，筛选差异表达基因；
•功能与通路分析：scTransform归一化后做NMF分析，UCell量化通路活性，结合KEGG、GO等数据库进行富集分析；
•分型与互作分析：scHLAcount量化HLA分型，scMetabolism分析代谢通路；降采样后用CellPhoneDB预测细胞互作，scTour、Monocle3分析细胞分化轨迹；
•表观与代谢分析：CUT&Tag分析H3K27ac等修饰在MHC-II基因上的结合；ATAC-seq分析染色质可及性；LC-MS检测代谢物变化，13C标记亮氨酸追踪代谢流向；
•公共数据整合：下载UCSC Xena的泛癌数据，用MCPCounter等三种算法构建中性粒细胞浸润共识评分，关联临床预后。整合50个公共空间转录组数据集，验证HLA-DR+中性粒细胞与T细胞的共定位；用dorothea V1.10.0分析转录因子活性，结合已发表的RFX5ChIP-seq数据验证其结合位点；
•组学联合分析：整合scRNA-seq与空间转录组数据，验证HLA-DR+中性粒细胞与T细胞的共定位关系；结合代谢组与表观组数据，揭示亮氨酸-乙酰辅酶A-H3K27ac-MHC-II的调控轴；联合TCR-seq与细胞共培养结果，明确HLA-DR+中性粒细胞对T细胞受体重排的诱导作用。

统计分析

1. 采用ANOVA检验、Student's t检验、Wilcoxon秩和检验进行组间差异比较；
2. 利用Spearman或Pearson相关分析评估变量间关联；
3. 通过log-rank检验分析生存数据，绘制Kaplan-Meier曲线；
4. 所有统计分析以P<0.05为差异有统计学意义，数据以均值±标准差或均值±标准误表示。

总结

研究意义

该研究构建了泛癌中性粒细胞单细胞图谱，首次明确其抗原呈递表型及调控机制，为中性粒细胞在癌症免疫中的双重作用提供了新解释；亮氨酸调控策略及抗原呈递中性粒细胞输注为免疫治疗耐药提供了新解决方案，具有重要临床转化价值。

文章复现

这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了，非常全面。

• 原始数据存储地址：PRJCA020880（中国国家生物信息中心）、http://www.pancancer.cn/neu
• 代码仓库地址：https://github.com/wu-yc/neutrophil（https://doi.org/10.5281/zenodo.10531210）、https://github.com/wu-yc/scProgram（https://doi.org/10.5281/zenodo.10531218）