想象一下，当你摇晃一瓶油醋汁后静置，油滴和水溶液会逐渐分离成两层。细胞内部也存在着一种精妙的“相分离”艺术，并且每时每刻都在发生。如今这种机制正成为疾病治疗的新靶点。这种被称为液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）的过程，是指在细胞内某些生物大分子（如蛋白质和RNA）通过相互作用，形成具有不同组分和性质的相分离液滴。这些液滴类似于油滴在水中的分离状态，形成了细胞内的一种独特的亚结构，让蛋白质和RNA等生物大分子在细胞质中形成无数动态的“液滴”，成为调控生命活动的关键枢纽。
PART.01
LLPS发展历程
早在20世纪40年代，材料学家就发现许多聚合物单体会在溶液中形成多价弱共价键，在达到饱和点后析出小液滴。2009年，德国马克斯普朗克研究所从事博士后研究的Clifford P. Brangwynne，在研究秀丽隐杆线虫胚胎时，观察到许多“发光”的小点在细胞内移动。这些后来被证实为P颗粒的结构，能够像液体一样融合、分裂和流动。几乎同时，德克萨斯大学西南医学中心的Michael Rosen团队发现，在细胞骨架形成过程中，三种相关蛋白质会融合形成液滴。这些开创性研究最终揭示，LLPS是细胞组织无膜区室的普遍机制。从此，相分离被引入到生物学研究中，特指生物大分子在胞内凝聚的特殊状态，描述的是胞内不同成分间相互碰撞、融合形成液滴，从而使一些成分被包裹在液滴内，一些成分被阻隔在液滴外的现象，用以解释胞内通过分子相分离，组织调控内部环境，形成无膜细胞器（如：核仁、miRISC、中心体、PML小体、应激颗粒、P颗粒、异染色质及突触的细胞骨架等）。并且生物大分子的相分离一般包含以下特点：
（1）分子由自由态转为聚合态，此过程动态可逆；
（2）相关蛋白具有高度保守的无规卷曲结构；
（3）存在精密的调控机制。
LLPS发展历程（Wang et al., 2021）。
PART.02
LLPS研究方法
1.生物学预测
研究LLPS通常从预测潜在相分离蛋白开始。目前科研人员已经建立起包括LLPSDB、CD-CODE、PhaSePro、PhaSepDB以及DrLLPS等在内的多个LLPS预测数据库，用于预测筛选潜在的相分离蛋白。
2.体外重建验证
LLPS体外验证的典型实验是将纯化的蛋白质混合，借助光学显微镜在特定缓冲液中观察液滴形成，获取液滴形成过程、大小以及固态样结构等变化。2019年《Biophysics Reports》发表的标准化协议详细描述了这一过程，包括蛋白质表达纯化、LLPS诱导及液滴生物物理性质研究。
3.体内实验验证
在细胞水平，则可利用荧光标记特定的蛋白质或RNA分子后，借助荧光显微镜观察其在细胞内的分布和聚集情况，并通过荧光漂白恢复实验分析荧光恢复动力学情况，评估区域内分子的流动性和交换性，检测LLPS过程。
PART.03
LLPS应用场景
1.疾病机制研究
2023年2月，德国马克斯·普朗克分子遗传学研究所和柏林夏里特医学院的研究人员在Nature发表的题为“Aberrant phase separation and nucleolar dysfunction in rare genetic diseases”研究性论文，引发了罕见病研究领域的讨论热潮。在全球已知的10名短指、多指和胫骨发育不育/发育不全综合征（BPTA）患者中，该研究收集了5名患者信息，研究发现，患者的HMGB1基因几乎存在着相同的基因突变，这是一种移码突变，导致了HMGB1蛋白中原本的无序区酸性尾被富含精氨酸的碱性尾所取代。从而影响了HMGB1蛋白的相分离，增强了其错误进入细胞核核仁的能力，导致核仁功能障碍，最终导致机体发育紊乱，揭示了一种罕见遗传病的发病机制。
体外验证引起BPTA患者HMGB1蛋白相分离的部分实验数据（Mensah et al., 2023）。
2.药物递送系统
基于LLPS的递送系统展现出独特优势：能够在靶位点原位形成高浓度药物储库，显著提高药物滞留时间；具备多重刺激响应释放能力；支持多种治疗分子协同递送。
2025年2月东京大学项目讲师小林美香、助理教授皆川义弘和野次裕之教授的研究团队在《Communications chemistry》发表题为“Metastable phase-separated droplet generationandlong-timeDNAenrichment by laser-induced Soret effect”的文章。该团队发现了一种方法，即使在关闭激光后，也能在水溶液两相系统中产生高度稳定的激光诱导LLPS液滴。利用这一新特性，研究团队成功地在高富集因子达数千的滴中实现了DNA富集，且该滴表现出极高的寿命；水滴滞留了两天以上。本研究所用系统可以富集其他生物分子，如RNA、蛋白质、抗体等，并且该方法允许我们实现液滴的模式化、分裂和聚合，为此前无法进行的生物和医学实验开辟了新的途径。
由富含DNA的液滴形成的心形图案（Kobayashi et al., 2025）。
3.基因表达调控
2021年7月，Sloan Kettering癌症研究中心的研究人员在《Cancer cell》发表的题为“N6-methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation”研究性论文。该文章发现髓性白血病患者中，YTHDC1是m6A修饰的阅读器，并且m6A 是 YTHDC1 发生液-液相分离并形成核 YTHDC1-m6A凝聚液（nYAC）的必要条件。此外，nYAC的形成有助于YTHDC1能够保护m6A修饰的mRNA免受PAXT复合物和外泌体介导的RNA降解。总之，m6A是通过相分离介导的核实体形成所必需的，对于维持mRNA的稳定性并控制癌细胞的存活和分化至关重要。
体内外水平证实YTHDC1的LLPS过程（Cheng et al., 2021）。
4.DNA损伤修复研究
2023年10月，郑州大学第一附属医院的研究人员在《Nucleic Acids Res》发表的题为“RAP80 phase separation at DNA double-strand break promotes BRCA1 recruitment”研究性论文。该文章证明在DNA损伤修复中，RAP80的LLPS是介导BRCA1招募的必要条件。细胞和体外实验均显示RAP80在DSB中的相分离过程，这被归因于其N端高度无序的区域（IDR）。与此同时，DSB发生后迅速形成的Lys63连接多泛素链强化了RAP80相分离并诱导RAP80的凝聚的。消除RAP80凝聚显著抑制了BRCA1焦点的形成，揭示了RAP80凝聚体在BRCA1招募和辐射敏感性中的关键作用。该研究揭示了RAP80介导BRCA1招募的新机制，为相分离在DSB修复中的作用提供了新见解。
RAP80在体外形成凝聚物（Qin et al., 2023）。
PART.04
我司案例
在过去的十年中，尽管LLPS的研究取得了一些突破，但对LLPS的理解仍处于起步阶段。越来越多的问题也出现了。例如，细胞内不同凝聚物特性调节的机制是什么？疾病相关突变或PTM如何调节凝聚物的物理性质？如何调节体内LLPS以达到预期疗效？目前FRAP被广泛用于证明LLPS的发生过程。伯远医学借助扎实的分子生物学实验平台，已开发出借助FRAP检测LLPS过程的相关业务，并积累丰富的项目经验，欢迎前来咨询交流。
参考文献
Wang B, Zhang L, Dai T, et al. Liquid–liquid phase separation in human health and diseases[J].Signal Transduction and Targeted Therapy,2021, 6(1): 290.
Wang Z, Zhang G, Zhang H. Protocol for analyzing protein liquid–liquid phase separation[J].Biophysics Reports,2019, 5(1): 1-9.
Mensah MA, Niskanen H, Magalhaes AP, et al. Aberrant phase separation and nucleolar dysfunction in rare genetic diseases[J].Nature, 2023, 614(7948):564-571.
Kobayashi M, Minagawa Y, Noji H. Metastable phase-separated droplet generation and long-time DNA enrichment by laser-induced Soret effect[J].Commun Chem,2025, 8:61.
Chen Y, Xie W, Pickering B F, et al. N6-Methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation[J].Cancer Cell,2021, 39(7):958-972.
Qin C, Wang Y, Zhou J, et al. RAP80 phase separation at DNA double-strand break promotes BRCA1 recruitment[J].Nucleic Acids Res, 2023, 51(18):9733-9747.
