新抗原解析：从G23/Tet1到HLNILSTLWKYR的完整筛选之路

我第一次在分析报告里看到“G23/Tet1：HLNILSTLWKYR”这一行时，第一反应是：这是不是某个基因注释工具抽风了？后来翻完文件头才反应过来，这是一个非常典型的肿瘤新抗原候选条目——G23 是样本编号，Tet1 是基因名，冒号后面是氨基酸序列。别小看这一行，围绕它可以拆出很多信息：样本来源、HLA 分型、突变类型、预测工具、验证实验，每一项都能聊出不少东西。

如果你正在做肿瘤免疫相关研究、生信分析，或者单纯在某个突变注释表里见过类似的“基因名：氨基酸片段”格式，那这篇文章就是写给你看的。我会把这一类条目的解析过程完整讲一遍，包括怎么拆命名、怎么分析肽段特征、这类条目通常怎么产生、怎么筛选和验证，最后再把我踩过的坑一起放出来。整体思路不限定某个具体课题，但流程和工具都是我实际用过的，可以直接照着复现。

1. 初次看到“G23/Tet1：HLNILSTLWKYR”时，别急着去 BLAST

很多人的第一反应是把这个序列丢到 BLAST 里看来自什么蛋白。这个方向没错，但在项目管理上有个更急迫的问题：你得先把命名的含义搞清楚，否则后面所有分析都会绕远路。

1.1 前两段实际上是一个压缩后的元数据

“G23/Tet1”这种写法，常见于用某个队列或样本集做突变新抗原筛选时的临时命名。

• G23：几乎可以肯定是样本编号，比如来自某个肿瘤队列的第 23 个样本。
• Tet1：通常是 TET1 基因的简写，注意这里大小写不规范。官方基因名应该是 TET1，属于 TET 家族，编码 DNA 双加氧酶，参与 DNA 去甲基化过程。
• 冒号后面的 HLNILSTLWKYR：一条长度为 12 的氨基酸序列，一般是从突变位点附近截取的肽段，或者是预测得到的新抗原候选表位。

这种命名在分析脚本里很常见：用样本 ID 加基因名加突变肽段，可以保证每条记录在项目里能大致定位来源。但它有一个明显缺点——看不到突变位点、看不到 HLA 分型、看不到是替换还是插入缺失。换句话说，这是一个“适合快速浏览、不适合直接回溯”的中间态命名。

1.2 先建样本字典，再拆数据

我见过不少人在拿到这类数据后直接开始做序列分析，最后发现样本注释和临床信息对不上，图表里的 G23 跟分组信息错位。所以我的建议是，在正式处理前先建一个样本字典表，至少包含：

解释一下为什么必须做这步：当你同时跑 20 个样本时，脚本输出的都只是“样本简写+基因+肽段”，如果你不把简写映射到完整信息，后面画图、分组、统计都容易出错。项目时间越久，这个表的价值越大，因为你不可能永远记住每个编号代表什么。

1.3 基因名一定要规范到 HGNC

“Tet1”这种写法在数据库注释里经常出现，但不同来源可能写 TET1、Tet1、tet1。做表位筛选前，我习惯先把基因名映射到 HGNC 标准符号。这样做的原因很实际：后续要查 TET1 在 TCGA、GTEx 里的表达量，或者提取它已知的突变位点信息，标准基因名是唯一可靠的连接键。

至于 TET1 本身，它是一个表观遗传调控关键基因，在多种肿瘤中都有突变报道。如果样本里出现了 TET1 突变肽段，下一步还要区分这个突变是不是功能丧失型、是不是肿瘤驱动事件，因为非驱动突变的免疫原性未必持久。这是我最初解析这条记录时的第一层判断。

2. 拆解 HLNILSTLWKYR：十二个氨基酸能看出不少细节

拿到肽段后，不要立刻跑亲和力预测，先把它的基本理化性质摸一遍。有时候仅仅这一步就能帮你排除掉一些不可能成为有效表位的候选。

2.1 先看组成：这是一个偏碱性、疏水性不低的肽段

把 HLNILSTLWKYR 拆成单字母氨基酸：

H（组氨酸），L（亮氨酸），N（天冬酰胺），I（异亮氨酸），L（亮氨酸），S（丝氨酸），T（苏氨酸），L（亮氨酸），W（色氨酸），K（赖氨酸），Y（酪氨酸），R（精氨酸）。

粗略判断：

• 带正电的氨基酸有 K、R，H 在生理 pH 下也有部分带正电，所以整体等电点偏高。
• 疏水残基不少：L、I、L、L、W、Y，因此疏水性不低。
• 没有 D/E 这类带负电的残基，也没有 C 和 M，不用担心二硫键或氧化问题相对较小。
• N 后面紧跟着 I，脱酰胺风险相对较低；如果 N 后面是 G 或 S，就要小心合成和储存过程中的降解。

如果手边有 Python，可以用 BioPython 快速算一下分子量、等电点和 GRAVY 值。代码不复杂：

from Bio.SeqUtils import ProtParam seq = "HLNILSTLWKYR" params = ProtParam.ProteinAnalysis(seq) print("分子量:", params.molecular_weight()) print("等电点:", params.isoelectric_point()) print("GRAVY:", params.gravy())

实际数值会随版本略有不同，但趋势是明确的：这是一个碱性偏强的疏水肽段。这个特点决定了两件很实际的事：一是溶解性可能不如亲水性肽段，合成时要考虑是否加精氨酸或赖氨酸促进溶解；二是它更容易插入脂质环境，也就更可能被抗原加工机器识别。

2.2 长度 12 到底是哪类表位？

HLA-I 类分子主要呈递 9~11 个氨基酸的肽段，HLA-II 类分子则偏好 13~25 个氨基酸的较长肽段。12 mer 正好卡在中间，这在具体应用中非常尴尬。

如果你的目标筛选是 CD8+ T 细胞表位，那么 HLNILSTLWKYR 只是“前体肽”，真正的呈递肽可能是里面包含的 9 mer 或 10 mer 核心序列。很多预测工具会自动滑窗扫描，但人工也要心里有数：在这个 12 mer 里面，可能潜藏多个不同的 9 mer 位移框，比如 HLNILSTLW、LNILSTLWK、NILSTLWKYR。它们与 MHC 分子的结合力可能差别很大。

反之，如果目标是 CD4+ T 细胞表位，12 mer 又有点短。通常需要更长一些的序列来保证 MHC-II 结合稳定。实际项目中，如果看到 12 mer，我习惯先确认当时的筛选策略是面向 HLA-I 还是 HLA-II，或者直接把它当成一个待裁剪的输入序列，交给后续工具处理。

2.3 锚定残基的初步猜测

MHC-I 结合肽的核心位置通常是第 2 位和 C 末端残基，这两个位置的残基被称为锚定残基。不同 HLA 分子偏好不同的锚定残基组合。

以 HLNILSTLWKYR 为例：

• 如果把第 2 位 L 作为主要锚定残基，C 端是 R。
• 如果截成 9 mer，选择不同位移框，第 2 位和 C 端会发生变化。

所以“这条肽能不能结合某个 HLA 分子”不能凭肉眼猜，必须配合后续的亲和力预测。真正要看的是：在某个特定 HLA 等位基因下，位移到哪个核心片段时结合评分最好。这也是接下来所有筛选工作的重点。

3. 这样的“样本/基因/肽段”条目一般是怎么生成出来的

要理解这个条目，你得了解它的上游流程。否则你只知道“这是一条肽段”，却不知道它从哪一步来，后面验证时会缺少上下文。

3.1 从组织样本到突变列表

通常，这类条目最早来自肿瘤样本的外显子测序或全基因组测序。测序数据比对到参考基因组之后，用 Mutect2、Strelka2 等工具找出体细胞变异，输出 VCF 文件。这里有一个重点：上游一定要有配对正常样本，否则区分体细胞突变和胚系突变非常困难。

这一步的常见坑是：突变的 VAF（变异等位基因频率）很低时，很多实际不存在的假突变会被混进来。所以我在进入注释前会加一道过滤，比如 VAF > 0.05、位点覆盖深度 > 20、在正常样本中 VAF < 0.02。这些阈值不一定适合所有数据，但能有效砍掉一部分测序错误。

3.2 用 VEP 或 ANNOVAR 把突变翻译成氨基酸改变

有了 VCF 后，用 VEP 或 ANNOVAR 注释突变是常规操作。注释结果里会给出类似 “TET1:p.Gly23Asp” 这样的信息，意思是 TET1 基因编码蛋白的第 23 位甘氨酸变成了天冬氨酸。

这里要注意：一个错义突变会在蛋白序列上产生一个点变化。围绕这个突变位点，通常会在左右各取若干氨基酸，形成一段突变肽段。比如取突变位点前后各 10 个残基，然后看最终输出序列。如果某样本中的 TET1 突变发生在 23 位，周围序列组合后恰好是 HLNILSTLWKYR，那这个命名就非常合理了。

不过，当前写入“G23/Tet1”的表述里并没有明确说突变是 p.Gly23Asp，所以不能完全确定。但无论如何，它的产生路径大概率逃不出“体细胞突变注释-外显子区域截取肽段”这个框架。

3.3 为什么没有直接把 HLA 分型写进命名

因为 HLA 分型通常是在后续新抗原预测阶段才加入的。最开始突变注释时，只关心基因和氨基酸变化。等到要预测 MHC 结合，才需要知道样本具体携带哪些 HLA-I 等位基因。

从流程顺序上看：

1. 样本突变筛查。
2. 突变位点侧翼序列提取。
3. 将侧翼序列用于 MHC 亲和力预测。
4. 预测结果里会同时给出 HLA 等位基因、肽段序列、结合分数。

所以“G23/Tet1：HLNILSTLWKYR”这个标签更像是第 2 步到第 3 步之间的过渡产物。它存在的主要意义是让分析流程中的每个脚本都能快速知道“这条序列来自哪个样本、哪个基因”。

4. 亲和力预测不是简单排序：我踩过的过滤器阈值坑

很多人觉得 MHC 亲和力预测就是跑一个程序、按分数排序、取前 10 个就完事了。实际操作远没这么简单，我最开始做新抗原筛选时，就因为阈值选得太激进，最后实验验证全军覆没。

4.1 常用工具差异很大，不能只看一个结果

主流的 MHC-I 亲和力预测工具有 netMHCpan、MHCflurry、MixMHCpred 等，各有各的打分体系。它们之间的关系更像是“多个角度的预测模型”，而不是可以互相替代的答案。

其中 netMHCpan 的结果常用 percentile rank 表示，这个值越小代表结合能力越强。但不同的 HLA 等位基因、不同工具的 rank 不能直接比较。我的习惯是三种工具都跑一遍，取交集或按照多个指标综合排序。

实际执行时，命令行参数长这样（以 netMHCpan 为例）：

netMHCpan -a HLA-A*02:01,HLA-B*07:02 -p peptide.fa -xls

注意：这里的 HLA 等位基因列表必须是这个样本的真实分型，而不是随便选常见型。如果你不清楚样本 HLA，跑出来的“高结合肽”在实验阶段可能根本不结合患者的 HLA 分子。

4.2 阈值怎么定？先看你的下游实验成本

有些文章会把 %Rank < 0.5 定为强结合，< 2 定为弱结合。但在实际项目里，阈值应该取决于你能验证多少个肽段。

如果你只有经费合成 5 条肽，那阈值肯定要严，比如 %Rank < 0.5、RNA 表达量高、突变 VAF 也高；如果你是在做筛选平台扩张，可以适当放宽到 < 2，然后用质谱验证来兜底。

我自己的顺序是：

1. 先用相对宽松的阈值保住召回率。
2. 再用表达量和克隆性数据把候选压下来。
3. 最后用多种预测工具的一致性排序决定最终实验名单。

4.3 肽序列不要只送“原始序列”，要做核心表位裁剪

当初我直接拿 12 mer 去跑实验，结果很多结合实验都是阴性。后来仔细看预测结果才发现，真正高亲和力的是内部的一个 9 mer 片段，而不是整个 12 mer。

所以在正式合成肽段前，建议做一次滑窗扫描：

• 从 HLNILSTLWKYR 中切出所有 9 mer：HLNILSTLW、LNILSTLWK、NILSTLWKY。
• 切出所有 10 mer：HLNILSTLWK、LNILSTLWKYR。
• 然后分别预测每个 frame 的亲和力。

这一步非常关键，因为在体内抗原加工时，长肽段会被酶切割成合适的长度再装载到 MHC 分子上。直接用 12 mer 做体外结合实验，不能代表最终呈递状态。

5. 从计算机预测到实验验证：一条候选肽的必经之路

你最终拿到的候选肽，必须经过实验验证才敢说“这是一个新抗原”。从预测到验证，中间还有好几个环节可以筛掉一堆假阳性。

5.1 先确认突变基因到底有没有表达

如果 TET1 在样本里根本不表达，那么即使它被预测为强结合，细胞内也拿不出足够多肽段去呈递。最直接的证据是 RNA-seq 数据。查看 TET1 的 TPM 或 FPKM，设一个经验阈值。我常用的简单标准是 TPM >= 1，或者至少大于样本总体表达分布的下四分位数。

不要只看基因表达量，还要看突变位点是否能被表达出来。如果突变位点在转录本中被剪接掉了，那就没有相应的突变蛋白。这种细节只有转录本结构注释才能暴露出来。

5.2 体外验证有哪些可选方案

针对 HLNILSTLWKYR 这一类的候选肽，验证路线通常有三种：

• T2 细胞结合实验：用不含 TAP 的 T2 细胞，外源加载肽段，抗体染色后用流式检测 MHC 分子上调情况。这个方案适合验证 MHC-I 结合力，但不是所有 HLA 型都有现成 T2 细胞系。
• 质谱检测内源性 HLA 配体：直接用免疫沉淀富集样本的 HLA 分子，洗脱肽段后做质谱鉴定，看 HLNILSTLWKYR 是否存在。这是最有说服力的证据，但成本高、流程长。
• ELISpot 或者四聚体染色：用患者外周血单个核细胞刺激后，看 T 细胞是否被激活。这是功能性验证，也最能说明免疫原性。

我的建议是：先做 T2 或亲和力实验确认结合，再做 ELISpot 确认 T 细胞应答，最后有钱有样本再上质谱。

5.3 合成肽段时要注意的稳定性风险

这条肽有两个需要留意的残基：色氨酸 W 和酪氨酸 Y。它们是氧化敏感残基，储存或操作不当容易降解。另外，序列中 N 后面是 I，脱酰胺风险较低，这是一个好消息。

拿到合成肽后，不要只看合成报告，建议自行跑一次质谱确认分子量。因为合成反应不一定百分之百纯，有时候会混入截短肽或氧化杂质。肽段溶解度也是一个麻烦，如果 12 mer 疏水性强，建议先用少量 DMSO 溶解，再逐步加缓冲液，避免在 PBS 里直接团聚。

6. 我处理这种记录时的几条实操建议

这个部分不是什么高深技术，但都是我在项目里被坑出来的经验。如果你正准备处理类似 “G23/Tet1：HLNILSTLWKYR” 这样的大量条目，建议直接照做。

6.1 一定要建一个“候选肽追踪表”

别把所有信息都塞在文件名里，那是最差的管理方式。我在实际项目中会维护一个 Excel 或单表数据库，字段大概包括：

这样每一条候选，不管过了多久，都能追溯上游数据。比单纯一个“G23/Tet1：HLNILSTLWKYR”这样的标签可靠得多。

6.2 完整的命名至少在内部要用

如果你要写脚本批量处理这些肽段，建议把内部命名改成更完整的格式。例如：

G23_TET1_p.Gly23Asp_HLA-A02:01_HLNILSTLWKYR

这样不仅保留了原始信息，还能直接拆出用于后续分析的各个字段。我后来就是因为早期命名太简略，导致有一条肽段合成了两次，而且两次序列还略有不同，纯属浪费时间和经费。

6.3 不要把全部赌注压在一个候选上

无论是单基因还是单肽段，都建议设置多候选并行验证。TET1 突变在肿瘤里可能只是人群中的一部分，而且免疫原性并不保证。最合理的逻辑是：每 10 条预测候选里，可能只有 1~2 条能走完整个验证流程。因此在筛选阶段就要控制节奏，不要把资源全投给某一条看起来很完美的序列。

根据我自己的经验，新抗原肽段项目如果要跑得稳，很少靠单一预测工具和单一实验路线。更靠谱的路径是：上游用完整上下文去过滤，中游用多种工具和 HLA 分型去交叉验证，下游再配合表达和质谱去锁定真正有意义的候选。经过这轮流程，你再看“G23/Tet1：HLNILSTLWKYR”这个标签，就会把它当成一条有生命周期的样本，而不是一串冰冷字符。如果以后你也在类似项目里看到这种简写记录，希望这篇内容能帮你少踩几个坑，至少先想到去查样本字典，再动手跑预测。