最近一直在做糖尿病肾病基底膜PAS染色切片，可结果总不尽人意。要么整张切片泛红、背景杂质重，根本分不清阳性区域；要么整体着色太浅，基底膜和细胞膜边界模糊，完全没法判读。
明明都是按标准流程一步步操作，可镜下观察总是出问题。
后来查了不少文献，也请教了师兄师姐才发现：染色翻车未必是染液本身的问题，更多是出在组织固定、脱蜡、氧化、梯度水洗这些细节步骤里。
其实做PAS染色遇到异常，没必要一上来就换试剂、盲目改孵育时间。更靠谱的做法是：先根据镜下的染色表现，判定故障类型，再一步步逐项溯源排查诱因。
我把这段时间实操总结的PAS染色常见翻车问题和对应解决办法整理好了，分享给做病理的小伙伴们参考。觉得实用的话，完全可以存下来或是打印贴在冰箱上，随时对照避坑。
一、出问题后，先看对照：别一上来就改参数
当PAS染色结果出现异常时，我们首先要做的不是换试剂，也不是调整时间，而是要先看阳性对照的染色情况。
如果阳性对照也异常，那可能是染色体系存在问题，我们需要优先查看过碘酸、Schiff等试剂是否过期、颜色是否正常，然后再核查水洗、复染等过程是否存在问题。
如果阳性对照正常，但染色背景普遍偏深，这时我们就要重点排查切片厚度、脱蜡水化程度及水洗、Schiff反应的时间了。
如果阳性对照正常而实验样本异常，我们要重点检查样本的取材位置、固定方式、糖原或黏液阳性物质含量等过程了。
所以，我们要先把问题分清楚，才能避免后面的调整不会变成“盲改”。
二、PAS染色异常快速排查表
建议大家先收藏这张表格。下次遇到颜色浅、背景深、染色不均、掉片等问题时，可以按照此表进行排查。
三、染色浅：要先考虑氧化时间
我们常说的PAS染色颜色浅，是指本应紫红色的基底膜、黏液、糖原或真菌细胞壁，只呈现出淡淡的粉红色，甚至看不见。遇到这种情况，我们可能会一上来就怀疑Schiff染液失效了，直接将反应时间延长10min。但是这样做有点“简单粗暴”了。
我们知道造成染色弱的原因有3个：氧化不足、Schiff活性差以及样本本身问题。所以排查思路应先看阳性对照的结果，如果其同样浅，则优先排查氧化和染色过程。如果阳性对照正常，则要重点查样本阳性物质含量、取材、固定这些因素了。
在排查染色过程时，我们需要先查看过碘酸和Schiff试剂是否过期、变质。Schiff需要避光保存，且在使用前要恢复到室温。过碘酸将糖类结构氧化出醛基是PAS染色的关键，氧化时间不足、过碘酸浓度过低，都会影响染色结果。我们一般使用1%高碘酸氧化15min。
四、背景深：先排查水洗操作
理想的PAS切片应该是阳性物质清晰、背景干净、层次分明，但是我们的切片常常会“红的发紫”，阳性物质和周围组织没有“边界”，背景一塌糊涂。
五、染色不均：重点查是否干片
你们是否碰到过这样的切片呢？同一张切片边缘颜色深、中间浅，或者局部颜色深浅不一，拍照时难选择合适的视野。遇到这种切片，我们可以按照下面的表格逐一排查：
六、染色浅：苏木素复染别超过2分钟
正常的PAS染色结果呈紫红色，但是现在的切片整体偏蓝紫色，阳性物质不突出。这时需要我们进行如下的排查：
复染整个过程时间较短，我们在操作时不应照搬别人的时间。因为不同实验室用的苏木素品牌、浓度不同，染色强度存在差异，我们应该先做预实验，摸索适合自己的染色时间。
七、切片脱落：先看烤片过程是否达标
在染色过程中，我们最担心的事情就是出现组织卷边、破碎甚至脱落。好不容易完成取材和切片，却在染色时掉片了。
频繁掉片，建议先查一下烤片操作。常规石蜡切片需要在60℃烤片30-60min。易脱组织可延长至1-2h，但不建议长时间高温处理，以免影响组织结构。切片的厚度也是需要考虑的，常规切片为3-5μm。此外，水洗的方式也很关键。流水不要直接冲击组织区域，应该让水流沿着玻片边缘缓慢流下。同时也可以使用防脱载玻片。
八、对照正常但样本不显色：别再反复换试剂
我们是否也碰到这样的情况呢？同一批的切片中，阳性对照染色结果很好，但实验样本不显色或明显弱于预期。这说明染色体系大概率是不存在问题的，更换Schiff试剂、延长氧化时间是解决不了问题的。
这时，我们需要确认样本阳性物质含量是否本就较低、取材是否包含目标区域、固定过程中是否造成阳性物质流失，糖原、黏液等受取材时间、代谢状态和固定方式影响较大。样本前处理不稳定，后面染色再标准，也可能看不到理想结果。
结语
总之，PAS染色异常时，比较忌讳的做法是颜色浅延长染色时间，背景深就随便缩短时间。我们应该采用更稳妥的思路解决问题：先看对照，再找问题，缩小参数调整范围。如果你的实验室刚好有人也要做PAS染色实验，可以把文中的排查表发给他。有备无患，当结果出现异常时能够快速找到原因，解决问题。
